Je begint in een Siciliaans klooster waar Agent 47 zich terugtrekt om bij te komen. Wanneer een Russische criminele organisatie hem opspoort, wordt hij gedwongen zijn oude werk weer op te pakken. Hitman komt erachter dat hij gebruikt is als pion in een groter plan, met een elite-eenheid van Russische Spetsnaz als zijn grootste bedreiging.
De game speelt zich af op uiteenlopende locaties zoals St. Petersburg en Japanse tempels, waar je in totaal 20 missies moet voltooien. Je kunt je voortgang opslaan tijdens deze missies en hebt volledige vrijheid in hoe je ze uitvoert. Kies je wapens en gadgets slim in, want je hebt keuze uit dolken, vuurwapens, explosieven en meer. Zichtopties zijn in zowel eerste- als derdepersoonsweergave beschikbaar.
Het wapenarsenaal is uitgebreid en handig, met onder meer vergiftigde pijlen, nachtzichtbrillen en andere gadgets. De artificiële intelligentie is verbeterd, waardoor vijanden realistischer reageren. Je verdient punten per missie die je kunt inwisselen voor extra wapens en bonussen. De soundtrack is gecomponeerd door een filharmonisch orkest.