In Prince of Persia: The Two Thrones keert de Prins terug naar Babylon samen met Kaileena. Hij vindt een verwoest koninkrijk en een complot tegen haar. Wanneer ze wordt ontvoerd en vermoord, wordt de Prins verbannen en ontdekt hij dat hij besmet is met de Sands of Time. Dit roept een Donkere Prins op, wiens geest hem langzaam overneemt.
Je speelt als de Prins en zijn donkere alter ego. Ze hebben verschillende wapens, gevechtsstijlen, krachten en verhalen. Met het Free-Form Fighting systeem kun je je eigen vechtstijl bepalen. Je kunt je vijanden op afstand wurgen of ze besluipen voor een verrassingsaanval.
In het spel kun je strijdwagenraces doen, waarbij je je vijanden moet ontwijken en dodelijke obstakels. Je vecht door de open omgeving van Babylon, op gevaarlijke daken en in chaotische straten. Je kunt de tijd manipuleren om je vijanden te verrassen, door de tijd te vertragen of terug te draaien.